Western Blot Là Gì – Western Blot Và một vài Lưu ý

Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose khả năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được dùng trong các thống kê lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. Vào thời kỳ này DNA cố định không được phân đoạn, chỉ đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu thập niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme Giảm khả năng được phân tách dựa trên cơ sở kí;ch thước của chúng. Từ đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là chuyển các đoạn DNA  phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose. Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh vào năm 1975. Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả. Mặc dù đã được cải tiến nhưng phương pháp đang được dùng ở nhiều phòng thí; nghiệm sinh học phân tử sai khác không một cách đáng kể so với phương pháp ban đầu.

Bạn đang xem: Western blot là gì

Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

-Cắt DNA bằng enzyme Giảm thí;ch hợp.

-Ðiện di danh mục cắt trên gel agarose.

-Làm biến tí;nh DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel): ví; dụ khả năng nhúng nó vào trong dung dịch NaOH 0.5M, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới khả năng chuyển lên màng lai.

-Chuyển DNA đã biến tí;nh lên màng lai. Thông thường màng lai được dùng là màng nitrocellulose. Người ta cũng khả năng dùng màng nylon. Màng nitrocellulose điển hình khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm2, trong khi màng nylon khả năng tiếp nhận 500µg DNA/cm2. Mặt khác màng nylon khả năng giữ DNA chắc hơn và í;t đứt gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạt tí;nh mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc khả năng dùng một thiết bị thấm chân không. Nếu dùng thiết  bị thấm chân không thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảng một tiếng. Trong quy trình chuyển, vị trí; các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi ngay.

-Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu. quy trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò). Ðể đánh dấu người ta thường dùng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học.

-Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu dùng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử  dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu dùng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.

Phương pháp Southern blot được thiết kế để xác định sự hiện diện, kí;ch thước, số lượng bản sao y, tí;nh đồng dạng của DNA trong một phức hợp. Ví; dụ, Southern blot khả năng được dùng để phát hiện một gen đặc biệt ở trong một genome nguyên vẹn.

Northern blot

Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, người ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot. Phương pháp này còn được gọi là Northern blotting, phương pháp lai Northern hay phương pháp lai RNA.  

Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

-RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng điện di trên gel agarose.

Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot

-RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ nguyên vị trí; như ở trên gel).

-RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.

Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot

-Vị trí; của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu. Enzyme kết nối với nó sẽ biến đổi thành một danh mục màu khả năng nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.

Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác định kí;ch thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA ở trong các mẫu khác nhau. Ðây là một phương pháp rất tốt để phân tí;ch sự biểu hiện của gen khi chúng ta cần định lượng để phân biệt sự khác nhau giữa hai mẫu và nó rất nhạy bởi vậy chúng ta khả năng điện di một lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel.

 Western blot

Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tí;nh đặc hiệu của kháng thể để phát hiện protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng lai.

   Western blot cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau.

Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương pháp lai thấm protein.

Western blot bao gồm các  bước cơ bản sau:

-Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.

-Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí; như đã phân tách trên gel.

-Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.

-Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có  enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.

-Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chí;nh xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.

-Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.

Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot
ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở thành một phương pháp được dùng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong thống kê, chẩn đoán và xét nghiệm bởi vì nó khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất nhỏ.

Xem thêm: Tải Monster Legends Hack 2020, Monster Legends

ELISA đã thay thế một vài kỹ thuật huyết thanh “cổ điển“ phức tạp, cồng kềnh tốn nhiều thời gian hơn và mở rộng phạm vi phương pháp phát hiện virus cũng như các marker liên quan đến sự nhiễm của chúng.

Xét nghiệm ELISA khả năng được tiến hành với một vài phương pháp như  ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ và “cạnh tranh“.

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan trong dung dịch đệm thí;ch hợp khả năng phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene). quy trình này khả năng là trực tiếp hoặc thông qua một kháng thể. Khi huyết thanh được thêm vào, các kháng thể khả năng kết hợp với kháng nguyên ở pha đặc (solid phase).

Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kí;ch thước 8cm x 12cm, chứa 8×12 giếng. Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kí;nh là 0,7cm (Hình dưới).

Ðĩa plastic dùng để tiến hành xét nghiệm ELISA

Các kháng thể dùng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng kết nối đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể kết nối với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì thế lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi ngay màu do hoạt tí;nh của enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên (Hình dưới).

Tí;nh nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tí;nh enzyme. Mỗi một phân tử enzyme bám vào kháng thể khả năng tạo ra hàng ngàn phân tử màu do hoạt tí;nh enzyme. Trước khi các kháng thể gắn enzyme khả năng được dùng rộng rãi, các kháng thể phóng xạ đã được dùng trong kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radio immuno assays-RIA). Kỹ thuật RIA như là một đột phá có ý nghĩa và người sáng tạo ra nó là Rosalyn Yalow đã được nhận giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học vào năm 1977.

Nguyên tắc của phương pháp ELISA
Phương pháp PCR

   Phương pháp PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) là một trong số những phương pháp được dùng rộng rãi nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử. Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993.

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chí;nh xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chí;nh xác cao.

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tí;nh sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì thế DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tí;nh phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này vận hành ở nhiệt độ rất cao, khả năng lên đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tí;nh.

DNA mẫu (DNA template)

Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA dùng có khuynh hướng giảm khi dùng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (

Sự hình thành nút cài tóc do mồi chứa trình tự đối xứng bậc hai

+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng danh mục primer dimer .

Sự bổ sung giữa hai mồi tạo nên primer dimer

+ Trật tự các base cũng gây tác động sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C có 3 kết nối hydro vì thế sự polymer hoá sẽ tốt hơn.

+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi khi đã bám vào DNA khuôn là 150-500 base.

Enzyme polymerase chịu nhiệt

Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để thống kê các vi sinh vật ưa nhiệt sống trong suối nước nóng 80-95 oC. Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao, có tên là Thermus aquaticus. Hai mươi năm sau, các nhà khoa học của tập đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy rằng DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Tag-polymerase) khả năng giải quyết vấn đề của enzyme biến tí;nh sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt dùng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase.

Từ đó đến nay, một vài vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để dùng cho phản ứng PCR như Vent- polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase, rTth…Các hoạt tí;nh của chúng được trình bày ở bảng dưới đây.

những loại nucleotid

Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được dùng ở dạng deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản ứng (200μM/loại nucleotid).

Nước

Nước dùng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt Giảm… Nói cách khác là không chứa bất kỳ một thành phần nào khác.

 Dung dịch đệm

Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 200mM Tris-Cl pH 8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)

Ion Mg2+

Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố tác động mạnh đến phản ứng PCR và nó tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 μM. Người ta thấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra ra nhiều lỗi hơn.

Giai đoạn lai (hybridization)

Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70 oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được dùng khoảng từ 3-5 oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ).

Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây ra nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều danh mục phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả.

Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tương đối là Tm=4(G+C) + 2(A+T)

Giai đoạn kéo dài (elongation)

Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR

Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và dùng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kí;ch thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kày của phản ứng PCR

Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp.

Sau mỗi chu kỳ, số bản sao y của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao y phân tử DNA

Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một vài lượng DNA theo mong muốn.

danh mục của phản ứng PCR được phân tách trên gel agarose đã nhuộm ethimidium bromide và quan sát dưới máy chiếu tia UV.

Phản ứng PCR với lượng danh mục tăng theo cấp số nhân

Phương pháp RT-PCR

Taq-polymerase không có hoạt tí;nh với RNA vì thế phản ứng PCR không thể dùng để khuyếch đại RNA một cách trực tiếp. mặc khác khả năng dùng kết hợp enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase-RT) với PCR để khuyếch đại RNA. Phản ứng này dùng khả năng của enzyme sao chép ngược để sao chép RNA thành DNA bổ sung sợi đơn và từ DNA bổ sung sợi đơn thành DNA bổ sung sợi kép. Sau đó DNA bổ sung sợi kép sẽ được khuyếch đại nhờ Taq-polymerase. 

danh mục của phản ứng RT-PCR là các phân tử DNA sợi kép tương ứng với phân tử RNA khuôn mẫu. RNA tế bào tổng số tách chiết từ mô hoặc tế bào được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng sao chép ngược.

Xem thêm: Clc Là Gì – Chuyện Thường Ngày: Trường

Ưu điểm của phương pháp này là cho phép thống kê các mRNA với hàm lượng rất thấp mà các phương pháp như Northern blot… không thể thực hiện được.

PCR được dùng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như tạo dòng phân tử, kỹ thuật di truyền, phát hiện chẩn đoán các bệnh (do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng…) cho kết quả rất chí;nh xác, di truyền học để sản xuất các marker phân tử, thống kê sự sinh ra các đột biến…, đấu tranh chống tội phạm, thống kê phát hiện mối quan hệ giữa người chết với người sống hoặc giữa các nhóm dân tộc… Mặt khác, việc phân tí;ch trình tự và thành phần nucleotid của DNA có tổng giá trị rất lớn trong việc định loại các loài sinh vật.       

Chuyên mục: Hỏi Đáp